Part-1
嘉宾介绍
范珊珊，从事高通量测序相关研究及基因组学研究多年，拥有丰富的基因检测及数据挖掘经验。曾负责商业测序数据分析软件技术及测序结果分析。
Part-2
公开课环节
各位老师，大家好，我是范珊珊。今天很荣幸和各位老师一起探讨一下智力发育障碍类疾病的基因检测措施选择。
智力发育障碍类的定义老师们肯定比我清楚，我就不赘述了。
智力发育障碍病因复杂，包括脑结构异常，遗传性病因，代谢性疾病导致，也有可能和感染、免疫、缺血、缺氧、颅内出血和创伤、围产期不良事件、中毒等原因造成。已有数据显示，约50%的IDD可能与遗传因素相关，包括单基因变异或染色体数目、结构异常导致。而针对先天性的脑结构异常、遗传性病因和代谢病性IDD现在已有不同的基因检测方式应用于临床检测，包括核型分析，芯片，低倍基因组、MLPA、全外显子组，panel，片段分析等。
今天很荣幸和各位老师分享一下现在市场上应用最多的2种检测措施，全外显子组测序和低倍基因组测序。
不同的基因检测措施，其实质根源是有其各自对应检测的变异类型。变异可分为静态突变和动态突变2大类。
最常见的是静态突变，又可以根据变异的大小不同分为A.碱基水平，包括点突变和插入缺失类变异；B. 染色体水平，包括染色体数目异常（如21三体，多了一条21号染色体），染色体结构异常。而碱基水平类的变异对应的检测措施是全外显子组测序，染色体水平类的变异对应的检测措施是低倍基因组测序。
动态突变指由DNA分子中某些短串联重复序列，尤其是基因编码序列或侧翼序列的三核苷酸重复扩增所引起。且重复次数会随着世代交替的传递而呈现逐代递增的累加突变效应。在智力发育障碍类，男性患者中最常见的脆性X综合征多数是由FMR1基因的动态突变引起。由于二代测序技术的限制，导致其对该类变异不可检出，故针对动态突变类的变异有一种专门的检测方法，即片段分析。
下面我分别介绍一下我们公司低倍基因组测序和全外显子组测序应用于智力障碍类疾病的几个检测案例。
低倍基因组测序，针对检测的变异类型的染色体数目、结构变异。
染色体病患者均有先天性多发畸形（包括特殊面容）、生长、智力落后或性发育异常、特殊肤纹等。故如果患者临床表现为发育迟缓、智力低下、各种畸形、生育障碍等的患者及其父母，如：
▪生长发育迟缓
▪ 特定的发育异常（如：头小畸形、身材矮小或巨头畸形、过度生长）
▪超过两项的面部畸形（如：五官间距过大，耳鼻异常）
▪先天畸形（如：心脏缺陷、手部异常）
▪癫痫发作
▪ 行为问题
可以首先考虑是染色体相关疾病问题。
染色体相关CNV检测主要是以下三种技术：核型分析、芯片、以及最新应用越来越多的低倍基因组测序。
核型分析是对常见的非整倍体检测的金标准基因检测全是野生型好是不好，其检测的灵敏度是在5Mb以上。
过去几年间，随着基因芯片技术的日渐成熟，这种方法也被应用于 CNV 的研究当中。它可以高效、快速的分析数以千计的基因组信息，具有高通量、微型化和自动化的特点。比较基因组杂交芯片（ ，CGH）和SNPs 芯片是目前应用较为普遍的芯片。
低倍基因组测序是近几年快速发展起来的应用二代测序技术检测CNV变异的一种新兴技术，其
▪测序范围：人体全基因组
▪测序深度：~1X
▪原始测序数据量：3G raw data
为了论证低倍基因组测序检测CNV类变异的准确性问题，现已有多篇研究通过比较核型分析，芯片，及低倍测序数据的结果来评级其准确性。
Liang D2014年的一篇研究报道，通过对62例具有发育迟缓、智力障碍和先天性异常的患者和10例流产组织样本使用低倍基因组测序技术用于检测CNV的可靠性。
芯片选用的是：-12 、探针密度：、基因组间隔19kb。
低倍基因组测序选用的是测序深度是0.1X（赛福基因选用的测序深度是~1X，灵敏度更高）。
使用CNV-seq 和SNP array两种检测技术筛查这72个样本的拷贝数变异，检测结果显示，2种技术的一致率能 到100%。而且这72个样本中检测到的43个拷贝数变异均能与已知的结构异常的疾病进行关联。且CNV-seq 检测到了5个 CNVs，长度小于1Mb(0.2-0.66Mb)，现还不能和疾病表型进行关联。
该篇研究证实，CNV-seq技术可以准确的检测染色体的结构异常，其准确率可以媲美中等密度的SNP array。
病例1
一个7岁的男孩，因临床表现认知不好，运动发育障碍送检，无家族史。选用的基因检测措施是核心家系低倍基因组测序(CNV-seq)。
检测出是在第 15 号染色体上q13.2-q13.3 区域发生了约 2Mb 的杂合性缺失（），父母未携带，是一个新发 CNV。送检者检出的CNV变异区域与15q13.3微缺失综合征相关，对应的表型包括发育迟缓，轻度或中度学习障碍。数据库中也收录了很多与该区域高度重叠的致病性或疑似致病性CNV的病例，与患者表型相似。
且父母的基因组信息在该区域是野生型，送检者是新发变异。故定义此段CNV为可以解释患者表型的疑似致病性 CNV。
第二种检测方法为全外显子组测序，针对的IDD病因中的遗传性、代谢病性疾病性类中的单基因致病。
我们来看一下这个病例。1岁7个月的女孩送检，主诉是：头型异常，左眼睑下垂，智力运动发育落后。临床诊断是智力运动发育落后。
选用的检测措施是家系的全外显子组测序。
检测结果：患者第 8 染色体的 位由 G 变为 T ，导致 CHD7 基因 .3 转录本所编码蛋白第 628 位谷氨酸发生终止，形成截短蛋白。
对应疾病是 综合征【MIM: 】，OMIM中记录的临床表型有小头畸形、上睑下垂、心房中隔缺损等心脏发育异常、严重程度不一的智力发育迟缓等，与患者表型相符。
变异位点是杂合，父母均是正常野生型，常染色体显性遗传，遗传模式吻合。
该位点对应的ACMG的致病变异评级为“致病性变异”：PVS1+PS2+PM2。
故最终定义该变异为可以解释患者表型的致病变异。
上一个病例临床主症就是智力运动发育落后，我们再来看一下这个病例：9岁10个月的男孩，主因是：自幼发育落后、反复抽搐（抽搐和发育落后的临床表现详见PPT）。新生儿期诊断为“新生儿缺氧缺血性脑病、新生儿低血糖”，送检医生的重点关注数据分析的疾病种类有：1. 孤独症谱系障碍； 2. 癫痫，强直 - 痉挛发作，痉挛发作基因检测全是野生型好是不好，肌阵挛发作，失张力发作； 3. 发育迟缓。
这一例送检者之前做过染色体核型及染色体微缺失，结果未提示异常。给我们公司送检，选择的检测方式是“家系全外显子组测序”。
全外数据分析结果检测到NALCN基因存在复合杂合突变，关联疾病是伴精神运动性发育迟滞和典型面容的婴儿期张力减退病【MIM:】。
该病在 OMIM 中的表型包括小头畸形，斜视，癫痫发作，精神运动发育迟缓，以及会存在一些面容特殊的表型等均与送检者的表型有相符之处。
遗传模式是常染色体隐性遗传，送检者的两个变异位点分别来自于父亲和母亲，遗传模式吻合。
故最终认为检出的NALCN基因变异是可以解释患者表型的疑似致病性变异。
这一例患者呢，则是由于代谢性疾病导致的发育迟缓和癫痫发作。
8个月的男孩，主诉病史：产道挤压。发育倒退，癫痫性脑病。点头拥抱，成串发作，全面性强直阵挛。异常脑电图，高度失律。肌张力少许减退。 MRI 显示脑白质病变，考虑异常代谢病？血尿筛查无异常。
无家族史，重点关注的数据方向有婴儿痉挛症和脑白质病变。
检测措施选用的是家系全外显子组测序。
检测结果提示的是ATP7A的半合子变异，对应疾病是铜代谢异常导致的 病。记录的临床表型有发育迟缓，癫痫（婴儿）痉挛，高度失律与送检者表型相符。
ACMG对该变异的评级是疑似致病：PS2+PM2+PM4。
送检者是男孩，X染色体半合子变异，父母均是正常野生型，为新发变异，遗传模式吻合。
最终定义 ATP7A基因该变异为可以解释患者表型的疑似致病性变异。
以上是分别选择低倍基因组测序或全外显子组测序进行临床辅助诊断类遗传病基因检测的几个案例，多数情况下，阳性的检出结果一种检测措施就可以辅助老师们的临床诊断了。但是遗传病确实复杂多样，有时却会碰到需用多种检测方法联合确诊的案例。
送检者是2岁的女孩，临床主诉是：整体发育落后，智力相当于 5-6 个月，坐不稳，不会独站，不会说话。偶尔盯着手看，脑电图异常，康复效果不明显， 3-4个月大开始白天睡觉晚上清醒，吞咽稍欠缺。临床诊断：发育落后。
当时送检选择的基因检测措施是：核心家系全外显子组测序+核心家系低倍基因组测序。
低倍基因组测序结果提示患者的第 15 号染色体上 q11.2-q13.2 区域发生了约 9.5Mb 的杂合性缺失（），父母该区域正常野生型，孩子是新发变异。
但是送检者检出的15号染色体的微缺失对应的疾病有2种： 综合征（母源性缺失）和 Prade-willi 综合征（父源性缺失）。
综合征：15q11-q13染色体区域母源性缺乏导致、父系单亲源二体，和的点突变导致。
Prade-willi 综合征：父系染色体基因小片段丢失的概率为65-75%、母系单亲源二体占20-30%、印记缺陷占1-3%。
低倍基因组测序数据是不能确定孩子中出现的缺失区域是来自于父亲的染色体或是来源于母亲的染色体的，所以通过低倍数据只能确定孩子出现了15 号染色体上 q11.2-q13.2 的微缺失，不能确定对应疾病是 综合征还是Prade-willi 综合征。
全外显子组测序数据：通过分析全外显子组测序数据15q11-q13父母缺失区域的多态性位点分布，结果提示患者该区域内不存在来源于母亲的变异，提示患者该区域可能为母源性缺失，对应的疾病是 综合征。
该病例是通过结合低倍基因组测序数据和全外显子组测序数据提示的送检者所患疾病可能为综合征。
由于送检者还未出现 综合征的典型临床表现，送检医生为了确诊，又补送了 综合征的甲基化MLPA，MS-MLPA结果显示15q11-q13 区域杂合缺失，甲基化状态提示为母源基因缺失。
至此：低倍基因组测序数据、全外显子组测序数据，MS-MLPA三种检测措施联合应用，确诊了送检者所患疾病为 综合征。
这也是多种检测措施联合应用的一个典型案例。
以上是智力发育迟缓类对应的2种不同的检测方法，那么对于IDD类患者应该如何选择基因检测措施呢？
我们来看一下IDD类的文章报道信息。
这是2016年发表于（IF 13.314）的一篇研究报道：该篇研究对121个患有ID的巴基斯坦的家系进行了全外显子组测序，共在30例家系中鉴定到了已知ID致病基因的致病性变异，阳性检出率为24.8%。
而由于全外测序是测定人体内几乎所有基因的全部外显区，故可以分析除现已知与ID类疾病相关的基因之外的基因变异信息，这也是全外显子组测序的一个主要优势，测序范围全面。该篇研究者共在另外30例家系数据中分析到了候选的新的可能与ID关联的基因变异。
53例家系中没有发现致病基因变异，另外8例则分析到多基因相关。
这是全外显子组测序数据检测ID类患者的一篇比较新的关于阳性检出率的报道：阳性致病性~24.8%。
我们再来看一下CNV类检测应用于IDD类患者的阳性检出率，由于低倍基因组测序应用于临床检测的时间较短，目前使用低倍基因组测序发表的文献报道还较少。以下2篇均为使用芯片类检测的阳性检出率的报道：
Di E 发表于2017年的一篇文章对1015名DD/ID 患者进行了array-CGH检测CNV，确定为非良性的CNV检出率为29%，致病性CNV的检出率是11%。
M分析了15767名有智力障碍和各种先天畸形的儿童以及8329名成人对照的CNV变异，CNV变异的总体阳性检出率是14.2%，长度多>。
使用CNV类检测措施，检测IDD类疾病的总体报道阳性率约是在10%~20%之间。
各种检测措施均有其对应的检测变异类型，也各有其局限性所在：
全外显子组测序优势是检测基因中出现的点突变和小片段的插入缺失，无法准确检出CNV类变异（现在由于生信算法越来越优化，使用全外显子组测序数据可以提示大片段类的CNV，但是由于全外测序本身实验的原因，使用全外显子组测序数据分析CNV可能会存在假阳性的问题，故全外数据分析CNV最好再用实验方法进行验证。）
低倍基因组测序优势是在检测>100kb以上的CNV，不可检测点突变和小片段插入缺失。
而MLPA和片段分析均是根据已知疾病的已知基因来设计实验的。
确实由于不同的基因检测措施的局限性，导致了临床医生在如何选取基因检测措施时比较困惑，那么有没有一种基因检测措施可以分析几乎所有类型的变异呢？
全基因组测序。
通常意义上说的全基因组测序和低倍基因组测序的区别是在测序的深度不同，全基因组测序一般是测30X，低倍基因组（多数是
这是2014年发表于上的一篇使用全基因组测序检测50例ID家系的研究报道，共在21名患者当中找到了阳性致病变异（20个新发，一个复合杂合），共鉴定到了84个新发SNV和8个新发CNV，总体的阳性检出率是42%。检出率明显高于只做全外显子组或只做CNV类检测的阳性检出率。
但是由于目前全基因组测序的测序和分析成本都比较高昂，限制了其在临床上的应用。
而全外显子组测序和低倍基因组测序两种检测措施互补，虽然与全基因组测序相比，检测CNV类的灵敏性稍低，但是对于大多数的IDD类临床患者来说，WES和CNV的联合应用确实是现在最为经济且有效的基因检测措施。
图1是美国IDD类患儿的评估和诊断筛选流程，若临床有怀疑的暂定临床诊断，会选择相应疾病对应的基因检测措施，结果若为阴性，会继续筛查脆性X综合征并送检CNV的芯片。若临床无暂定的临床诊断国外现在是先做脆性X综合征并送检CNV的芯片。
目前针对ID/DD类患儿可提供的基因检测措施有全外显子组测序，低倍基因组测序，MLPA和动态突变类检测。从已有的IDD类患儿的不同基因检测措施来看，点突变和CNV类变异的各自检出率相差不多，而我们公司已有的ID/DD类患儿的全外检出率和CNV-seq的检出率也相差不多。
故针对ID/DD类患儿，若经济条件允许，为保证更高的阳性检出率，全外显子组测序+低倍基因组测序是现在可选的最优的一种解决方案。
感谢各位老师的聆听，若有任何不妥之处，还请各位老师批评指正。
Part-3
问答环节
观众a:
范老师您好，请问你们用的低倍基因组测序的测序深度是多少？可检测多大片段以上的CNV？
范珊珊老师：
测序范围是全基因组，测序深度是在1X左右，检测的CNV变异大小是在100Kb以上。
观众b:
范老师您好，MLPA可以认为是针对某一种疾病的CNV吗？
范珊珊老师:
可以简单这么理解，MLPA是查看某个基因是否存在外显子的缺失和重复。（但是CNV的定义是大于1Kb以上的缺失、重复，有一些基因的外显子的缺失重复可能没有这么大）。
观众b:
谢谢老师，那就是MLPA其实是比CNV检测到的小一点的重复或缺失？
范珊珊老师：
MLPA多是针对某一个确定基因看有没有外显子的缺失重复的，和低倍基因组测序在整个基因组范围内看CNV是不一样的。
观众c:
感谢范老师的精彩讲座，我对动态突变不理解，请您稍做解释。
范珊珊老师：
请看下图，这样更容易理解动态突变。
观众d:
低倍基因组测序只有一倍深度怎样保证数据的准确性？
范珊珊老师：
针对低倍基因组测序检测CNV的准确度问题，现在已经有多篇文章通过比较低倍基因组、核型分析、芯片来确定低倍基因组的准确性。您如果感兴趣的话，我可以把文章发给您。
观众e:
范老师您好，CNV-Seq不能检测哪些染色体结构异常？
范珊珊老师：
CNV-Seq不能检测下列染色体结构异常：染色体整倍体、染色体平衡易位、
观众f:
第一次听赛福讲座，谢谢您的讲解！请问低倍基因组测序技术中深度0.1X VS 1X， 经济成本和数据质量的可解读性具体是怎样的？
范珊珊老师：
现在的测序多是按照测序数据量来收费的，0.1X和1X在测序成本方面，可以按照数据量换算一下。可解读性：目前国内多数的产前检测用的多是0.1X的，遗传病检测用的多是1X的，主要是检出的灵敏度的问题，但是在PPT中提到了0.1X的测序也检测到了20KB左右的CNV，所以具体的可靠性和差异这一块不是很了解。
观众f:
您的WES+ + MLPA是否检测出或者倒位？在什么情况下需要做核型分析？
范珊珊老师：
没有检出过易位和倒位的问题；如果患者只选择了做患者一人的低倍测序，结果我们检出阳性的情况下，如果片段很大，会推荐患者和父母再做一些核型或是qPCR等进行验证。
观众g:
请教范老师，低倍基因组测序不能确定2岁女孩中出现的缺失区域是来自于父亲或来源于母亲，不能确定对应疾病是 综合征还是Prade-willi 综合征。对于这样的病例能否选择MS-MLPA分别进行检测，进而确实为哪一种病？就是不选用WES，而选择CNV-Seq和MS-MLPA呢？
范珊珊老师：
只根据CNV-seq的检测结果，我们是可以推荐患者做MS-MLPA确诊的。但是由于这个患者当时是同时送检的CNV-seq和WES，所以就用了3种检测方式。
Part-4
下期公开课预告
第31期赛福基因公开课：《营养信号通路在新生儿先天性发育缺陷疾病中的调控作用研究》，将在北京时间2018年7月5日（周四）晚6:00上线，本次公开课的讲者嘉宾为来自中山大学附属口腔医院的许宝山博士。本次公开课的问答环节将在7月8日周日晚7-8点于「基因大讲堂——遗传神经科研与临床」微信群内进行，欢迎老师申请加入。
第32期赛福基因公开课：《单细胞癌症进化谱系方面的最新研究进展》，将在北京时间2018年7月12日（周四）晚6:00上线，本次公开课的讲者嘉宾为来自麻省理工学院-哈佛博德研究所（Broad of MIT and ）的陶利明博士。本次公开课的问答环节将在7月15日周日晚7-8点于「基因大讲堂——肿瘤科研与临床」微信群内进行，欢迎老师申请加入。
Part-5
往期回顾
第二期
第
第
第五期
第六期
第
第
第
第
第
第
第
研究