药物通透性在新药发现和开发阶段的评估策略
来源
药学学报
作者
李文倩，韩静静，张贤，徐润泽，杨劲
中国药科大学药学院药物代谢研究中心
摘要
通透性是影响口服药物生物利用度的一个关键性因素，因此，新药 研发的早期阶段，准确及高效的评估药物通透性至关重要。工业界通常将平行 人工膜渗透技术（ assay, PAMPA）和 Caco-2 细胞模型作为早期评估方法，目前，尤斯灌流大鼠模型也被广泛的应用。本篇综述首先总结了人体内单次灌注技术 （in vivo -pass , Loc-I-Gut）的数据—金标准，然后着重介绍了三种体外方法的基本原理、实验操作、效率、与人体内有效通透性（ , Peff）数据和人体吸收分数（ , Fa）的相关性，以期为在新药发 现和开发的不同阶段使用正确的通透性方法提供建议。
关键词
口服药物；通透性；平行人工膜渗透技术；Caco-2；尤斯灌流；有效通透性；吸收分数
正文
口服给药在现代药物治疗方案中占据主导地位，与其他给药方式相比，它 安全、有效且患者依从性好[1]。口服制剂的开发需要深入进行吸收机制的研究， 不但可以预测口服给药的生物利用度的大小，还可以预测食物、pH 等因素对生 物利用度的影响，以便为制剂的处方优化、未来上市后仿制药的生物豁免等提 供依据。因此如果能在研发早期了解化合物的肠道吸收机制, 可以提高研发效率 和节约成本[2]。口服药物的吸收机制研究，通透性是决定性参数之一[3]。本文将 药物的―‖译为通透性，而不是渗透性。因为肠道吸收是一个复杂的 动态过程，包括被动跨细胞扩散、载体介导的主动转运和外排以及细胞旁路途 径，而渗透性从字面意思看仅意味着一种被动的过程[4]。
工业界通常将平行人工膜渗透技术（ assay, PAMPA）和 Caco-2 细胞模型两种方法合用作为药物研发早期的通透性预 测方法，但是目前尤斯灌流（ ）大鼠模型以其吸收窗评估优势也 被应用[1, 4]。这些方法的准确性主要依赖人体内单次灌注技术（in vivo , Loc-I-Gut）30 个药物的通透性结果进行判别[5]。
本文首先介绍了金标准实验 Loc-I-Gut 的基本内容，总结已有的人类通透性 数据，然后介绍了三种方法的基本原理、实验操作、效率、与人体内通透性数 据（ , Peff）和人体吸收分数（ , Fa） 的相关性。期望为在药物研发早期的不同阶段正确的使用各种体外通透性模型 提供建议。
人体 Loc-I-Gut 实验
1.1 方法介绍
空肠是多数哺乳动物对大部分药物的主要吸收区，它具有最大的表面积，是肠道中最活跃的载体介导转运位点[6]。最常用和最有效的临床上测定空肠近 端 Peff 的技术是 Loc-I-Gut[7]。任何用于预测人体肠道吸收的体外模型都必须从 对照相应的人体体内数据进行验证开始，这些预测的基础是与 Loc-I-Gut 的历史 Peff 测量值具有相关性[6]。目前，已有 30 种药物的人体肠道通透性通过 Loc-IGut 已被测定，见表 1。
1.2 实验操作
Loc-I-Gut 研究是在健康的受试者进行的。如图 1 所示，受试者的上喉被麻 醉后，将外径为 5.3 mm 的聚氯乙烯管经口插入小肠。该管有 6 个通道，末端连 有两个相距 10 cm，各 40 mm 长的乳胶囊通透性，它们分别与其中一个较小的通道相 连，在管的中心的两个较粗的通道分别为灌流的流入管和流出管，其余的周围 小通道用于给予标记物质和/或引流[5]。根据充分搅拌模型来计算 Peff：
式（1）中 Cin和 Cout是灌注液流入和流出时药物的浓度；Qin为单次灌注的 速率;r 为灌注肠段半径（约 1.75 cm）；L 为灌注肠段长度。
1.3 效率
Loc-I-Gut 实验操作繁琐，价格昂贵，且涉及伦理学的问题，因此无法大规 模的用于药物的筛选。
1.4 准确性
将这些空肠 Peff值转化为肠道吸收半衰期（half-life of , t1/2,abs）值， 再与传统药代动力学（, PK）数据分析，即血药浓度曲线计算出 的相应 t1/2, abs值进行比较，进一步分析这些空肠 Peff值的有效性。从选定的药物 子集的空肠 Peff值（基于公式 2 计算）获得的 t1/2，abs值与临床 PK 研究（口服溶 液或速释制剂）获得的―真实‖体内吸收数据非常吻合（图 2）[7]。并且这些药物 的人体空肠 Peff 值具有位置和时间依赖性，但仍然能够预测整体 Fa[7]。这都说明了 Peff能反映药物在体内的―真实‖吸收[6, 7]。因此，目前人体 Loc-I-Gut 试验是 通透性实验的―金标准‖。
式(2)中 V 是经灌注肠段的液体体积，约为 60 mL[7]。
内容由凡默谷小编查阅文献选取，排版与编辑为原创。如转载，请尊重劳动成果，注明来源于凡默谷公众号。
PAMPA
2.1 基本原理
Kansy 等[10]于 1998 年首次提出 PAMPA 技术。PAMPA 是以人造的非细胞脂 质膜（可在滤膜上涂上不同的有机溶剂，如十六烷[11]，或用不同的磷脂和胆固 醇溶解于十二烷或 1,7-辛二烯中[12-16]）为基础，它没有孔隙、主动转运载体和 代谢酶，被用于预测候选药物的被动跨细胞渗透性[17]。PAMPA 可耐受大的 pH 范围及高的二甲基亚砜含量（最高 5%），因此可以评估不同 pH 条件（酸性和 碱性）的化合物的通透性[18, 19]。
2.2 实验操作
PAMPA 方法是用滤膜将 96 孔板和 96 孔滤板分成两个隔间（供体室和受体 室）。供体室中加入待测化合物的缓冲溶液（pH 5.0～pH 7.4），受体室中加入空 白缓冲液（pH 7.4 左右），如图 2 所示[20]。在 37 ℃环境下，通过一段时间内测 定受体室透过的药物量进而计算得到通透性，这种通透性常被称为有效通透性 （ , Pe）[3]，根据公式（3）计算：
式（3）中，A 为人工磷脂膜的面积（cm2）；VD 为供体腔的体积（mL）；VA为受体腔的体积（mL）；t 为通透时间（s）；CA(t)为在 t 时间受体液的浓度；CD(t)为在 t 时间供体液的浓度。
2.3 效率 PAMPA
可以采用平行的方法进行，不需要培养，人工屏障是在进行实验时 制备[20]，并且 PAMPA 中化合物的浓度可以使用 96 孔微板，通过紫外分光光度 法测定，这大大提高了效率。PAMPA 筛选一批药物大概需要 4 h，每周可测定 约 650 个化合物，是一种高通量的通透性筛选模型[2]。
Caco-2 细胞模型
3.1 基本原理
Caco-2 细胞源自人结肠腺癌细胞系，以标准条件在半透膜上培养，分化完 全的 Caco-2 细胞与正常人肠上皮细胞的形态结构非常相似，具有紧密连接，形 成顶膜侧（, AP）和基底外侧（, BL）结构，能在顶膜表面分化 出刷状缘绒毛 [21, 22]。并且与 PAMPA 不同的是，Caco-2 细胞能表达肠道转运体 和酶，有可能预测主动转运和有多种转运体的药物相互作用[23]。
3.2 实验操作
Caco-2 细胞单层实验如图 3 所示，将细胞置于细胞培养附着的装置中（如 小室），细胞接种在多孔滤膜上。大约 21 天后，细胞在滤膜上形成分 化的单层。培养好的 Caco-2 细胞模型可以进行待测物的双向转运实验，加入转 运蛋白抑制剂可以确定化合物是否为转运蛋白的底物。根据公式（4）计算表观 通透系数（ , Papp）
式（4）中，dQ/dt 为单位时间内药物通过 Caco-2 细胞单层的转运量，以药物的累积转运量（Q）对取样时间（t）作图后，该直线的斜率为 dQ/dt；A 为小 室的膜面积；C0为给药侧药物的初始浓度。
3.3 效率
Caco-2 细胞模型需要 21 天的培养周期，并且必须使用 LC/MS 或 HPLC/UV 用于药物定量[1]。与 PAMPA 相比，Caco-2 细胞模型的通量较低，成本较高。但 是，Caco-2 细胞模型可同时大批量的药物进行快速筛选，并且所需药量较少， 与繁琐的动物模型相比，省时又经济。因此，Caco-2 细胞模型通常被认为是中 等通量的通透性筛选模型，大概每周可以测定 50 个化合物[2]。
尤斯灌流大鼠模型
4.1 基本原理
尤斯灌流技术是目前常用的研究胃肠道通透性的体外方法之一[24]。尤斯灌 流大鼠模型使用切除大鼠的肠组织，能够保持肠道结构的完整性，模拟胃肠道 的生理环境，可结合肠道代谢来研究药物的转运[25]，同时研究不同肠段（十二 指肠、空肠、回肠和结肠）的吸收，并且该方法也可以研究各种药物-药物相互 作用对吸收的影响。
4.2 实验操作
该方法（图 4）是将大鼠肠道截取后，将离体肠段的浆膜层组织分离，随 后将肠片固定在互不相通的黏膜和浆膜腔室之间的孔上，将测试化合物添加到 组织的黏膜或浆膜侧，可分别研究吸收和分泌方向的转运[26]。Papp 的计算方法 与 Caco-2 细胞模型相同。
4.3 效率
尤斯灌流大鼠模型实验需先剥离大鼠肠段，再将黏膜层的组织分离，且黏 膜易破损，操作技术复杂，并且由于前置时间较长加上肠道活力的限制, 该方法 与 PAMPA 和 Caco-2 细胞模型相比通量低，一套装置 1 天大概只能检测 1 个药 物浓度[2]。
PAMPA、Caco-2 细胞模型和尤斯灌流大鼠模型的准确性评估
尽管 PAMPA、Caco-2 细胞模型和尤斯灌流大鼠模型均已被广泛使用，但是 受实验方法、质量控制值及环境等因素的影响，对药物通透性的测定在实验室 与实验室之间存在差异，有的差异甚至高达 100 倍[27]。因此，汇总不同实验室 之间的体外通透性数据与人体内通透性数据进行绝对值比对是不明智的。
作者汇总了不同实验室之间的独立研究的药物在这三种体外模型的通透系 数，与人体有效通透性（Peff）进行相关性研究：纵坐标为以 Lg（人 Peff）为纵 坐标，Lg（体外 Papp或 Pe）为横坐标做线性回归所得的相关系数（r2），见图 6。PAMPA 数据[28-31]中仅包含以被动扩散为主要转运方式的药物，相关性良好；Caco-2 细胞模型数据[6, 32-40]中阿莫西林、头孢氨苄、左旋多巴、赖诺普利和依 那普利拉是氨基酸或肽转运蛋白的底物，这些蛋白在人和细胞中表达差异≥10 倍，剔除这些药物后，相关性良好；尤斯灌流是大鼠空肠的数据[41-45]，相关性 很好。
作者从三种模型中各选择一个相关系数较高的实验室[29, 40, 44]，将其获得的 药物通透性数据结合人体空肠通透性数据与 Fa 进行相关性研究[7]，如图 7 所示， 四种通透性评估方法和 Fa 之间呈现类似的趋势且相关性良好，同样的 Fa，不 同方法对应的通透性由小到大的顺序依次是：Caco-2 细胞模型、PAMPA、尤斯灌流大鼠模型、人体 Loc-I-Gut 方法。因为在单位面积下，由于环状皱褶、绒毛 和微绒毛的存在，使小肠黏膜的表面积增加 600 倍，因此人和大鼠肠道所吸收 药量远高于 Caco-2 单细胞层[7]。尤斯灌流大鼠模型方法为离体的大鼠组织，没 有血液循环，导致漏槽条件不满足，所以同样是小肠组织，其通透性结果低于 人体结果。PMAPA 的结果受不同实验室人工膜制备方法的影响。
结 语
PAMPA、Caco-2 细胞模型和尤斯灌流大鼠模型均已证明与人体内 Peff和 Fa相关性良好，是目前用于筛选化合物通透性和吸收的有价值的研究工具。在药 物发现和开发的初始阶段，它们是可以在短时间内以最少的资源预测新化学实 体（new , NCE）的通透特性和肠道吸收。从这些体外方法中获得 的结果不应孤立地解释，而应一起评估，甚至需要结合化合物特征（溶解度和 稳定性等）的数据。
因为三种模型不同的特性（表 2），能提供不同的通透性信息，三种体外模 型可以灵活应用在药物发现的不同阶段，见图 8。首先，应使用在两个 pH 条件 （pH 5.5~6.5 和 pH 7.4）下进行的 PAMPA 筛选所有测试化合物的被动跨细胞扩 散，这分别提供了化合物在酸和碱中的信息通透性，并提供了肠道吸收和组织分布的 初步评估。如果新药在 PAMPA 上具有良好的通透性，则可利用 Caco-2 细胞模 型进行 AP-BL 方向上通透性的二次评估，并将其数据进行比较，以确定主要的 通透性机制：PAMPA 和 Caco-2 细胞模型线性相关表明被动扩散占优势；如果 PAMPA > Caco-2 细胞模型，则表明可能存在外排机制。在 Caco-2 细胞模型分析过程中， 建议使用特定的转运蛋白抑制剂对 BL-AP 方向也进行通透性研究。尤斯灌流大 鼠模型的建立有助于进一步证实前期的研究结果，了解药物吸收过程中的代谢 信息，深入了解药物的通透性机制。
另外，仿制药人体生物等效性的生物豁免需要申请人提供药物通透性信息， 这类注册申报用数据需要符合 GLP 要求。FDA 生物豁免审评结果表明，通透性 实验不规范是审评发补或不批准的重要原因[46]。如何建设规范的通透性实验室 我国尚处在摸索之中。作者贡献：李文倩为本文的第一作者，负责本文的选题、文献收集及主要内容 撰写；韩静静、张贤和徐润泽负责本文的指导、内容把关与修改；杨劲教授为 本文的通讯作者，负责本文的选题、框架设计、指导、修改以及内容把关。利益冲突：作者声明无利益冲突。
参考文献
详见药学学报