近年来-Cas9作为一种新的便捷基因编辑手段，大大降低了基因编辑所需门槛。与其他广泛使用的基因编辑技术如TALEN和锌指核酸酶（ZFN）等相比nk细胞疗法是不是在中国叫停了，有一个重要优势，即使用起来更加容易也更快。先前大多数技术都需要从头开始创建分子，以便在特定的DNA序列中做出改变。而在中，同样的Cas9分子可以通过简单合成，提供一个向导RNA（gRNA）分子来靶向到任何序列。此外，基于-Cas9的临床应用也不断被报道，其在治疗HIV、白血病、单纯疱疹病毒性角膜炎、杜氏肌营养不良等疾病上都取得了令人振奋的结果。
不过有喜也有忧。-Cas9作为一种外源导入的基因编辑系统，在基因编辑过程中会造成DNA断裂，引发DNA损伤毒性，同时其脱靶毒性也是一个主要问题。
2021年11月11日，来自美国国立卫生研究院（NIH）的研究团队在 上发表文章，报道了在应用-Cas9系统进行基因编辑，尤其是基因敲除的过程中，具有癌症相关基因（p53、KRAS等）突变的细胞被富集（对致癌细胞生存的选择偏向性）的现象较为普遍。这些发现强调了对接受基于-Cas9的基因编辑疗法来修饰癌症相关基因突变患者及时监测的必要性。
针对脱靶毒性问题，一些实验室已尝试通过重新设计Cas9来降低其脱靶效应，但这些Cas9版本往往通过牺牲基因编辑效率来提高准确性。可喜的是，2022年3月2日，美国德州大学奥斯汀分校的研究团队在 期刊发文报道他们首先发现了-Cas9基因编辑系统中脱靶背后的结构机制，并在此基础上重新设计了Cas9蛋白——-Cas9。这种新的Cas9脱靶概率比原始版本Cas9要降低4000倍，又能维持同样高的编辑效率。
文章第一作者 Jack Bravo打了一个比方：不同实验室开发的各版本Cas9 就像不同型号的自动驾驶汽车，多数型号都很安全，但最高速度只有10英里/小时，虽然安全性提高了，实用性也消失了。而-Cas9则是一辆可以全速行驶且非常安全的自动驾驶汽车。”
具体来说，-Cas9基因编辑通过gRNA将Cas9酶靶向目标DNA序列，Cas9酶切割目标DNA双链从而实现基因编辑。gRNA（长度为20bp）通过与目标DNA的碱基互补配对来识别需要编辑的位点，然而有时在第18-20个碱基不匹配时，Cas9酶仍能进行编辑，从而导致脱靶效应。
文章通讯作者 和David 开发了一种称为动力学引导结构测定的技术，他们使用冷冻电镜拍摄Cas9与这种不匹配DNA相互作用时的活动快照，惊讶地发现，当Cas9在第18位到第20位遇到这种类型的错配时并没有放弃并继续前进，而是有一个手指状的结构突入并抓住DNA，使其表现得好像它是正确的序列。
通过RuvC域稳定扭曲的18-20 MM（来源：）
通常情况下，错配会让DNA有点松散，但这种手指状的结构使它稳定。如果没有增加DNA的稳定性，Cas9就不会采取其他必要的步骤来切割DNA并进行编辑。而在此之前，从未有人观察过这个多余的“手指”做的这种稳定作用。表示若不是这项研究，可能永远无法想象会发生这样的事情。
基于这一开创性发现和见解，研究团队重新设计了Cas9酶，即-Cas9。它的手指状结构部分被改造成远离DNA，从而在错配时不会用来稳定错配结构，Cas9酶就不再在错配位点切割和编辑DNA序列。
对Cas9脱靶效应背后的结构机制的深入研究为下一代Cas9变体的设计提供了分子蓝图。这些新版本可以减少安全问题，同时保持高效的on-基因编辑。该团队目前正在与其他研究人员合作以测试-Cas9在活细胞中的基因编辑功能。
当然，在认识到DNA脱靶切割是一个关键弱点后，其他研究团队也一直在进行调整。为了提高系统的精度，加利福尼亚大学伯克利分校的研究人员构建了一种称为的Cas9变异体，它只能在特定类型的细胞中激活。
其他Cas酶也已被探索。斯坦福大学的一个研究小组设计了的变体（），其大小不到目前使用的 系统（Cas9 或）的一半， 可以驱动高水平的基因激活（增加高达数千倍），而天然的系统在哺乳动物细胞中无法发挥作用。此外，由的先驱 共同创立的基因编辑生物技术公司 也在研究小型Cas酶，包括Cas14和Casɸ。一个较小的酶尺寸可能允许科学家添加其他成分来微调-Cas系统。
专家点评
徐天宏
贝斯昂科创始人兼CEO
徐天宏博士，毕业于复旦大学，临床医生，美国贝勒医学院分子和人类遗传学博士。主要科研成果包括世界上第一个发现了一种重要的遗传性心脏病ARVC的最主要致病基因PKP2。在生物医学领域具有20年临床医生、科研、创业和风险投资经验，拥有多项生物技术的发明专利，曾担任一家领先的临床诊断公司董事长CEO，于2021年4月正式创立贝斯昂科，公司专注于研发新型基因编辑NK细胞治疗产品及遗传病治疗产品。
医药魔方Pro：首先能否请您点评一下最新发表在杂志上题为 “ basis for by –Cas9” 的这项研究进展？
徐天宏：这篇文章利用冷冻电镜从结构角度分析了脱靶产生的原因，让我们更清楚地看到了脱靶发生的过程。本研究发现了不同位置错配对于脱靶效应的影响，其中18–20位置的错配更易产生脱靶。进一步作者发现Cas9蛋白的RuvC结构域对脱靶产生至关重要，其能够稳定gRNA与靶位点结合形成的构象，导致脱靶。最后作者通过对RuvC结构域的突变获得了既能保持高效靶向编辑又能降低脱靶效率的高保真Cas9。目前作者提出的高保真Cas9主要是应用于体外研究。相比体外，细胞内的DNA更加复杂，受到表观修饰，核小体等影响。我们也期待高保真Cas9在哺乳动物细胞内具备类似体外那样高活性、低脱靶的效果。
医药魔方Pro：目前解决–Cas9脱靶编辑问题有哪些潜在途径？
徐天宏：目前对-Cas9的脱靶问题提出了不同角度的解决方法。我认为大致可以分为两类。一类是从生物信息学角度，去选择特异性高的位点设计sgRNA，目前也有多种软件可供选择。第二类是从编辑发生过程去改善特异性 ，比如利用高保真性的Cas9，利用两个切口酶形式的Cas9实现基因的敲除，改变Cas9的递送方式如利用Cas9蛋白来减少Cas9的作用时间，还有就是可以对sgRNA进行修饰等多种方式减少脱靶的发生。
医药魔方Pro：您如何看待“应用-Cas9系统进行基因编辑，具有癌症相关基因（p53、KRAS等）突变的细胞被富集的现象较为普遍”这一研究结果？针对该问题可以有哪些解决方案？
徐天宏：利用-Cas9进行基因编辑，主要是利用了这一工具对DNA双链进行断裂。DNA双链断裂对细胞来说是不友好的，细胞内存在多种酶监控这种断裂，如p53，以便发现断裂及时启动修复机制。如果断裂得不到及时修复，细胞就可能诱导凋亡。所以如果p53发生了突变，细胞将不会凋亡，继续存活，进而得到了富集。这样的事件发生比例可能较低，比如百万细胞里有几个发生。但如果这样的突变细胞应用于临床，就可能造成严重的风险，比如癌变等。所以，不造成DNA双链断裂就可以对基因进行编辑将是以后的应用方向。比如碱基编辑和向导编辑，其利用切口酶形式的-Cas9系统，结合脱氨酶或者逆转录酶，在不造成DNA双链断裂的情况下实现基因编辑。
医药魔方Pro：据了解，贝斯昂科拥有多个自主知识产权的底层基因编辑专利技术，能否介绍一下公司专有技术的一些特色？
徐天宏：碱基编辑相比-Cas9技术不会造成DNA双链断裂，对基因组更友好，更适合应用。但碱基编辑蛋白可能对一些单链DNA或者RNA产生随机脱氨，造成非特异的编辑。贝斯昂科的专利技术针对这一问题，经过大量的探索和尝试，将脱氨酶进行了包装，构建了新的人工蛋白碱基编辑器ceBE，使其只能在和靶位点结合时才发挥高效脱氨作用，使得在DNA和RNA水平的脱靶率都大幅度降低到了背景突变率的水平。这个核心底层专利技术从申请到获得中国国家知识产权局授权仅花了14个月，并已经申请国外专利。目前贝斯昂科的这一专利已经通过了中国和美国的FTO分析。此外，贝斯昂科还有多个碱基编辑的专利技术。
向导编辑是一种最新的基因编辑技术，能够在不依赖DNA双链断裂和供体DNA的条件下便可有效实现所有12种碱基转换。但其缺点是尺寸偏大，编辑效率低。贝斯昂科申请了中国第一个向导编辑（PE编辑）的专利技术，公司的向导编辑是目前世界上编辑效率最高的，平均达到50%的编辑效率。
基因编辑是现代生物学的一项重要技术，有着非常广阔的应用前景，该领域的底层专利技术至关重要。我们看到哈佛大学和加州大学伯克利分校进行了旷日持久的-CAS9专利之争，双方都志在必得，这两个学校在美国，欧洲和中国都分别获得了专利授权。哈佛大学还拥有一项碱基编辑的核心专利以及的专利。目前很多中国的生物医药公司在产品开发过程中都用到了基因编辑技术，或者干脆就是基因编辑基因治疗的产品，要合法商业化使用基因编辑技术只有两个方案：1）争取从相应的专利权人如哈佛大学或加州大学伯克利分校那里获得相应的授权，但授权通常局限于某个特定适应症和中国地区，并且要支付高昂的授权费用及版税；2）开发自己的基因编辑专利技术，但这异常困难nk细胞疗法是不是在中国叫停了，想要能够比现有的基因编辑/碱基编辑技术具有优势，又有 To ，几乎成了不可能完成的任务，但贝斯昂科做到了这点。
最近我们留意到美国最主要的碱基编辑公司发表的文章采取了我们的碱基编辑技术开发临床产品，也引用了我们对应的文章。我们知道之前生物医药领域大多数情况是Copy to China, 而现在则是美国主要的生物技术公司Copy From China。当然，由于对方还只在早期研发阶段，不涉及到专利侵权问题。
医药魔方Pro：除了，去年 基于 TALEN 基因编辑技术的CAR-T产品出现染色体异常，相关临床试验被FDA叫停。最后，能否请您谈谈传统的基因编辑技术（、TALEN、ZFN等）存在哪些改进空间？
徐天宏：基因编辑技术的应用越来越多，同时，一些相关的问题也随之浮出水面。问题的出现有助于推动开发更加安全高效基因编辑工具，最终能够更好的服务于临床应用。传统的基因编辑技术通过造成DNA双链断裂实现基因的编辑，这一方式也被证明了存在一定风险。后续的改进应该是继续利用这些技术的靶向作用，利用蛋白工程，通过不同蛋白结构域的组合，如激活因子，抑制因子，表观调控因子，脱氨酶，逆转录酶等，最终实现更精细的改变或者调控。
参考资料：
1#Jack Bravo et al. basis for by –Cas9. . 2022
2#Sanju Sinha et al. A -wide of -Cas9 . . 2021.
3#Gene Gets Safer to （来源：UT NEWS）
4#UT safer Cas9 with gene （来源： ）
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