CHIP虐我千百遍，我待CHIP如初恋。
在科研界，CHIP无疑是高冷的女神，实验汪们在追逐的过程总是分分钟被虐的体无完肤，糟心的实验结果更是让实验汪们分分钟想去“狗带”。征服CHIP的路上，有多虐心就有多少要注意的地方。庆幸的是，曾得到女神青睐的前辈们积累了不少经验。好的经验要分享，小鱼特地总结了各位高手们做CHIP的经验，在此奉上，希望能助大家一臂之力。
染色质免疫共沉淀（ ，CHIP）是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的“金标准”方法，能够比较真实的反应细胞内转录因子TF与启动子的结合情况。
其基本原理：在活细胞状态下，把胞内DNA与蛋白质交联成复合物，通过超声或酶处理将染色质随机切断为一定长度范围内的小片段，然后利用抗原抗体特异性识别反应，将与目的蛋白结合的DNA沉淀下来，特异性富集目的蛋白结合DNA片段，进而对目的片断进行纯化与检测（如qPCR、基因芯片、测序等），从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
CHIP主要分为两种：交联染色质免疫沉淀（Cross-，XChip）和自然染色质免疫沉淀（ , NChip）。
两者的区别在于XCHIP需要甲醛固定，适合于结合力较弱的DNA-蛋白质相互作用的研究；而NCHIP则不需要甲醛固定，不需要交联反应，主要用于组蛋白修饰（如组蛋白H3和H4，它们本身与DNA结合非常紧密）、核小体定位的研究。在NCHIP中，DNA结合蛋白与DNA之间保持一种自然状态，需要采用微球菌核酸酶对染色质进行消化。
一般而言，我们所提的染色质免疫共沉淀指的是XCHIP。那么长话短说，小鱼就将XCHIP三天实验中的常见流程及注意事项分享给大家。
第一天
细胞的甲醛交联
1）收集细胞，加入甲醛（终浓度为1%），37℃孵育10min后，加入甘氨酸（终浓度为0.125M），混匀后在室温下放置5min即可。
2）离心弃上清，收细胞于15ml离心管中，用3ml预冷的1×PBS洗两次后，预冷后 5min收集细胞。
3）弃上清，按照细胞量，加入SDS Lysis ，使细胞浓度为1×106个/100 ul。再加入蛋白酶抑制剂复合物。
Tip:
1、细胞生长状态要好，因其生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，可能会影响你所研究的TF与的结合。因而，一般细胞长到75%-80%比较好。
2、交联程度会影响到超声破碎的效果，交联程度越高ep管和离心管的区别，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段，背景色加深；交联不充分，则只有一部分靶蛋白与结合，富集得到的的量不高，产生实验假阴性。建议样品交联的时间为2-30min。
3、用SDS重悬细胞时，要选用小的tip头，在液面下吹打，否则很容易产生气泡，会对后续超声破碎带来不便。
超声破碎
1）冰上孵育10min后，利用超声波或微球菌酶将染色质随机切为200~的小片段。离心10min（4℃），转移上清于1.5ml EP管中。
2）取出100ul超声破碎产物，加入4ul 5M NaCl（终浓度为0.2M），65℃处理4h进行解交联，电泳检测超声破碎的效果。
3）另取出100ul超声破碎产物，加入900ul ChIP 和20 ul的50× PIC，再加入60ul A / Sperm DNA，去除非特异性。4℃颠转混匀1h后，离心3min，收集上清。
Tip:
1、不同细胞系需不同的超声时间才能达到最优效果，则可通过时间梯度的超声来选择最优超声条件，如下图所示：
2、每份超声样品取50ul，标记为input，用于定量DNA浓度（稀释200倍，测OD260）和作为PCR空白对照。同时超声后样品应立刻存于-70℃中，避免多次反复冻融。
3、加入 A / Sperm DNA之前一定要混匀，因为 sperm DNA是很粘稠的物质，若不混匀，后面beads量不一样，对实验结果产生影响。
第二天
免疫共沉淀
1）一管加入1ul抗体，另一管中则不加抗体作为对照。4℃颠转过夜。
2）孵育过夜后，每管加入60ul A / Sperm DNA，沉淀抗体/抗原复合物，4℃颠转1h。 4℃ 3min 收集沉淀，弃上清。
Tip:
1、每个样品都采用25ug的DNA量，同时抗体的量为1-10ug的抗体/。
2、单抗与多抗的选择也需慎重考虑。单抗特异性强，背景低，但是识别位点单一，在CHIP甲醛交联过程中，很有可能该位点被其他蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有此问题ep管和离心管的区别，但是特异性差，背景可能会偏高。一般建议选择多抗；选择单抗时要注意其识别位点需远离靶蛋白与核酸结合的区域。
3、下图显示了蛋白A和蛋白G珠子对于不同免疫球蛋白同型的亲和力
纯化DNA片段
1）依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗过程：加入溶液1ml，在4℃旋转5min， 3min，去除上清。
洗涤液：
低盐免疫复合物洗脱液，洗一次
高盐免疫复合物洗脱液，洗一次
氯化锂免疫复合物洗脱液，洗一次
TE ，洗两次。
2）清洗完毕后，进行洗脱。每管加入250ul洗脱液，室温下颠转15min， 3min，收集上清液。最终的洗脱液为每管500ul。
洗脱液：
100ul 10% SDS，100ul 1M ，800ul ddH2O ，共1ml。
3）解交联：每管加入20ul 5M NaCl（终浓度为0.2M），混匀后，65℃解交联过夜。
Tip:
1、洗涤时，前几个步骤可以不用洗的太干净，但最后一个要尽量吸取干净，必要时可用gel tips吸取上清液。
2、含beads的样品离心时，转速不能太快，防止beads破碎，但如果采用的是磁性的beads就不存在这个问题。
3、解交联时，建议在离心前，先把蒸发到离心管盖子上的部分离下来。
第三天
DNA样品的回收
1）每管加入1ul （MBI），37℃孵育1h。
2）每管加入10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris.HCl（pH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶K。45℃处理2h。
3）DNA片段回收—OMEGA胶回收试剂盒，最终的样品溶于100ul ddH2O
Tip:
1、样品中SDS含量较高时，普通PCR回收试剂盒进行DNA片段回收时，在过柱前，可在样品中加入一定量的异丙醇，这样可有效消除SDS沉淀。
2 、一个CHIP一般需要3~4天时间，其中有几个步骤是可以停下来的：
（1）细胞收集：用含蛋白酶抑制剂的PBS洗涤离心，去上清的细胞收集液可置-80℃冻存；
（2）用SDS重悬细胞后可置-80℃冻存；
（3）超声破碎结束时，离心后的上清置新的离心管后可置-80℃冻存；
（4）解交联后的标本可置-80℃冻存
DNA样品分析
如果目的蛋白的靶序列已知，或怀疑某一序列是目的蛋白靶序列，可选用定量或者半定量PCR方法。
如果目的蛋白的靶序列未知或要研究目的蛋白基因组分布情况，找出转录因子结合位点，则可采用CHIP克隆测序（CHIP-seq）、CHIP-chip等方法。
PCR分析
目前检测方法主要有3种：
CHIP-qPCR：用于比较沉淀的模板与阴性和阳性对照信号强度的相对精确的定量PCR方法。成本较低。此外，还有一些由ChIP衍生出来的方法，如RIP（即用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析时需先将RNA逆转录为cDNA）。
Tip :
1、1~10ul的移液枪取3ul以上才比较准确，要考虑好自己PCR反应体系的配置。
2、每次qPCR之前都要把离心保证取样的准确。
CHIP-chip：Chip和DNA微阵列芯片技术结合是种高通量分析DNA和蛋白质结合或翻译后染色质和组蛋白修饰的方法。即将经过染色质免疫共沉淀的DNA样品纯化后进行PCR扩增，然后用荧光素标记（如Cy3）。对没有经过免疫沉淀反应富集的Input DNA 样品也进行扩增，并且用另一种荧光素标记（如Cy5），作为结合背景的参照。之后将这两种DNA杂交于包括基因组序列的微阵列芯片上，转录因子结合的靶序列用每个点相应的荧光强度来确定。
CHIP-seq：在测序深度和范围足够的情况下,ChIP-seq可以检测到所有的组蛋白修饰所对应的DNA 结合位点。ChIP-seq首先通过染色质免疫共沉淀技术特异地富集目的蛋白结合的DNA片段,并对其进行纯化与文库构建,然后以NGS 技术对富集到的DNA 片段进行高通量测序。
（NGS技术主要是利用DNA新模板的合成或连接过程, 用高效平行的方式同时对DNA模板进行测序, 从而获得大量的测序数据, 即所谓的大规模平行测序。）
综上，小鱼用一张图简要列出CHIP大致流程。
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