药物代谢组学是新药研究过程的重要研究内容，本文阐述了如何进行代谢产物分析及鉴定。
超高效液相色谱法结合四极杆飞行时间质谱法对大鼠和人类体内的依非韦伦代谢物进行的研究，结合软件对大鼠和人类体内的依非韦伦代谢物进行研究。考虑到代谢物之间的极性差异，采用了固相萃取和蛋白质沉淀的方法制备样品。根据精确分子量或二级碎片信息（M2数据），确定了代谢物的结构。通过上述方法，鉴定出15种代谢物，包括11种来自大鼠样品和13种来自人样品的代谢物。
1背景简介：
EFV（，依非韦伦），结构见图1，是当前国内免费药物首选的一线抗HIV病毒药物，属于人类免疫缺陷病毒-1型（HIV-1）的选择性非核苷反转录酶抑制剂（NNRTI），通过非竞争性结合并抑制HIV-1逆转录酶（RT）活性，作用于模板、引物或三磷酸核苷，兼有小部分竞争性的抑制作用，从而阻止病毒转录和复制。它在许多治疗HIV的联合方案中被发现是有效的，并对高活性抗病毒药物的发展做出了重要贡献。
超高物。效液相色谱与高分辨质谱联用(HRMS)，根据精确分子量可以准确的给出物质的元素组成，这在分析复杂基质中的未知样品时是非常给力的。本研究建立了一种超高效液相色谱-ESI-Q-TOF-MS方法，用于鉴定大鼠和人尿中EFV的体内代谢。
2.材料与方法
具体参考原文献
2.3 样品制备
样品的制备过程是通过SPE在 C18 ODS柱（100毫克，1毫升；安捷伦）上进行样品制备，以分离和富集尿样中的代谢物。
首先用2mL甲醇和2mL纯水对柱子进行处理。将一份尿液（1毫升）装入预处理过的SPE柱。装在预处理过的SPE柱上，用2毫升的水清洗，然后用200μl甲醇连续洗脱、取10μl并注入仪器进行分析。考虑到代谢物之间的极性差异，蛋白质沉淀也用于样品制备。在50μl尿液中加入100μl甲醇充分混合。混合物在15000×g下离心10分钟，取10μl上清液进行分析。
2.4 仪器和分析条件
安捷伦1290超高效液相色谱仪（, , ）与Q-TOF-MS/MS（LC/MS-Q-TOF; LC/ R 5600+, AB SCIEX, City, CA）配合使用，ESI源。高效液相色谱仪配备了二元泵、二极管阵列检测器、自动进样器、和柱温箱。色谱条件：色谱柱 C18柱（2.1×100毫米，1.7um）、柱温30℃、流动相A（2mM的甲酸铵和0.05%的甲酸在水中）和流动相B（乙腈）。流动相B的比例在25分钟内从30%增加到85%，进样体积为10μl。
在MS和MS/MS实验中，使用EFV对仪器进行优化，以获得最佳参数。采用负离子模式，离子源温度550℃。氮气作为雾化气及碰撞气体。MS分析是在m/z100-1500范围内进行的，参数如下：离子源气体1和2（GS1和GS2），分别为50和60psi；离子喷雾电压-4500V;去族电压-80Vm7二极管参数，碰撞电压 -40V
3.结果与讨论
3.1优化质谱检测条件
采用正负离子两种模式对EFV进行分析。结果表明负离子模式比正离子模式产生更多质谱信息。因此，后面的ESI分析中选择了负离子模式。研究同样发现在移动相中加入甲酸可以增强未知代谢物的信号强度，有助于识别未知代谢物。为筛选最优质谱条件，尝试了不同浓度的甲酸（0.01、0.05和0.1%v/v）和甲酸铵（1、2和5mM）。结果显示当0.05%的甲酸和2mM的甲酸铵加入到流动相中时灵敏度最高。因此，选择0.05%的甲酸和2mM的甲酸铵的流动相进行LC-MS分析。
3.2初步确定EFV的代谢物
EFV在大鼠和人类尿液中的代谢物通过.5软件进行识别（提取的代谢物离子色谱图显示在 Fig.S1中），代谢物的信息汇总在表1中（详见原文），在大鼠和人的代谢物中没有观察到明显的差异。
EFV(M0) 保留时间为12.28min，母离子峰[M–H]− m/z314.0201，特征二级离子碎片m/z270.0291、250.0234、247.9722、 244.0169、 241.9990、230.0166、 221.9921、216.0213和 68.9981.
M1-M3在m/z 330.0187处观察到[M-H]−分子离子峰，表明它们是EFV羟化代谢物的异构体。上述代谢物在大鼠和人类样品中都被发现。M1-M3的离子碎片信息如下所示：
M1与M2的二级离子碎片信息相似度较高，而M3则差异较大。M1在二级离子碎片信息m/z 286.0271、263.9691、257.9958、246.0143、237.9893、230.0445、210.0377、182.0424和162.0261，其中大部分比相应EFV(M0)的高16Da，说明M1羟基化位点发生在苯环上，根据取代的空间位阻，取代位点可能发生在C8上；同理M2的羟基化位点可能发生在苯环的C7上。部分碎片的来源是分子中二氧化碳的中性丢失以及随后的HCl和HF的丢失。m/z 286.0271的碎片是由m/z330.0107的二氧化碳丢失产生。HCl、HF、乙烯（C2H4）和环丙烯（C3H4）的丢失分别导致了m/z250.0491、266.0192、257.9958和246.0143的离子峰。从m/z246.0143开始，HCl、HF和HCN的连续损失分别导致了m/z210.0377、182.0424和162.0361的离子峰的出现。在m/z263.9691处的碎片是由m/z330.0107处的乙炔环丙烷(C5H6)的损失形成的（支持信息图S2）。除了在m/z 330.02231分子离子峰强度明显降低外，M2与M1具有相似的裂解碎片。
M3具有如下离子碎片m/z263.9700、260.0131、232.0177、 213.9720和68.9980 m/z。263.9700离子碎片表明羟基化位点发生在N-原子上，M3的裂解行为如下图2。
图2. M3及其离子碎片裂解行为
M4的[M-H]-分子离子峰m/z 490.0538，在大鼠和人类样品中都有发现。M4显示了EFV的典型碎片离子峰，在m/z 244.0165和250.0233处，以及在m/z 175.0237（）和113.0257（）处m7二极管参数，这些都是由葡萄糖醛酸产生。这种代谢物是由EFV与葡萄糖醛酸直接共轭形成的，因此初步认为它是N-葡萄糖醛酸（因为这是唯一可与葡萄糖醛酸共轭的位置）。
M5的[M-H]-分子离子峰为m/z394.0107。该代谢物仅在人类样本中发现。在EFV上增加的80Da的质量，与EFV具有相同的特征框架碎片m/z244.0169，表明M5是EFV的硫酸化代谢产物。与M4相似，该位点只能发生在氮原子上，见图3。
图3. M5结构及裂解行为
M6和M7的分子离子峰[M-H]-为506.0377，比EFV多192Da，表明发生了羟基-葡萄糖醛酸化作用。M6在大鼠和人样本中均有检出。离子碎片信息 m/z 330.0170（丢失），说明葡萄糖醛酸发生在EFV-羟基位点上。M6的离子碎片信息与M1相似，为M1进一步代谢产物。M7为M6的异构体，仅仅在人样本中有检出。根据离子碎片信息，为M2的葡萄糖醛酸化产物。
M8和M9分子离子峰[M-H]-为409.9844，比EFV多96Da，表明发生了羟基-硫酸盐代谢物。M8在大鼠和人中有检测到，但M9仅在人样本中均有检出。与M6，M7相似，M8，M9分别为M1和M2的羟基-硫酸盐代谢物。
M10和M11分子离子峰[M-H]-为346.0154，比EFV多32Da，表明发生了二羟基化。M11具有特征碎片m/z 262.0071,表明丢失了CO和环丙-2-烯醇，这表明其中一个羟基化位点发生在环丙烷上、另外一个羟基化位点发生在苯环上。
M12 分子离子峰[M-H]-为m/z522.0494,在人样品中有检测到。M12与M10具有相识的离子碎片m/z346.0097(丢失)，表明M12为M10的葡萄糖醛酸化产物。
M13 分子离子峰[M-H]-为m/z425.9724，在人样品中有检测到，通过质谱碎片信息分析，M13为M10的硫酸盐代谢物。
M14在m/z604.0113处显示了一个[M-H]-峰。该代谢物仅在大鼠样本中发现。 基于离子碎片和以前的研究[7]，M14被认为是EFV的半胱氨酸-甘氨酸-硫酸化代谢物。
M15[M-H]-峰在m/z546.9902，主要碎片峰m/z467.0316、379.9994、316.0014、309.9934、282.0148、276.0072、274.0250和263.9684（表1,原文献），而M15仅在大鼠样本中发现，被确定为半胱氨酸硫酸化的代谢物。
3.3总结
EFV及其代谢产物与代谢途径见图4。
（1）苯环及N原则位点可以羟基化。
（2）上述羟基化位点可以进一步被葡萄糖醛酸化和硫酸化
（3）侧链的环戊烷可以羟基化
（4）侧链的炔基团可以和半胱氨酸加成以及进一步甘氨酸化
图4. EFV及其代谢产物与代谢途径
参考文献：J.Sep.Sci.2015,38,1529–1536
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